磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒說(shuō)明書(shū)

磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰膽堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類(lèi)酶的總稱，廣泛存在于高等動(dòng)植物和細(xì)菌等多種生物體中，具有參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。

測(cè)定原理：

磷脂酶D催化水解磷脂酰膽堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽堿，膽堿在膽堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下將4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無(wú)水乙醇。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體102mL×瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體3mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加1mL無(wú)水乙醇充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體15mL×1瓶，4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，4℃避光保存。

酶液提?。?/span>

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

3.        血清：直接測(cè)定。                  

測(cè)定操作：

酶活計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /mg prot）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /g 鮮重）=  ×C標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T = 16.7×÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /10⁴ cell）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7×÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /mL）=  ×C標(biāo)準(zhǔn)÷T=16.7×

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

b.        用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /mg prot）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /g 鮮重）=  ×C標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T = 16.7×÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /10⁴ cell）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7×÷細(xì)胞數(shù)量

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol膽堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD活性（nmol/min /mL）= ×C標(biāo)準(zhǔn)÷T=16.7×

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

注意事項(xiàng)：

1.        顯色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃離心5min后取上清測(cè)定。

2.        吸光值不宜超過(guò)1，否則用試劑一將酶液進(jìn)行稀釋，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。